Em formação

Quanto sal [NaCl] é demais na precipitação do DNA?


Em extrações de DNA, quanto é muito sal em um tampão de extração CTAB? Os protocolos oscilam em torno de 2,5 molar; se você passar por isso (por exemplo, 25 molar), você saturará sua solução e precipitará o DNA muito cedo?

Antecedentes: A maioria dos protocolos de extração de DNA aproximam o seguinte:

  1. ~ Lise física
  2. ~ Lise química (detergente)
  3. Separação de fases (etapa temida de fenol-clorofórmio-isoamil)
  4. Precipitado, seco

As variantes são abundantes, mas uma característica comum das etapas 1 2 é a inclusão de CTAB e NaCl no tampão de extração - detergentes e sais ajudam a romper a membrana celular, mas (talvez mais importante) CTAB "seletivamente" complexifica e precipita impurezas orgânicas (sacarídeos, proteínas ...) enquanto DNA / RNA são deixados em solução.

Para que isso funcione, a carga negativa líquida do esqueleto de fosfato de DNA (PO4-) precisa ser neutralizada, permitindo que o DNA permaneça em solução: íons de sódio (Na +) são atraídos para os grupos regulares (PO4-), embora de forma mais irregular cargas espaçadas * em proteínas etc. associam-se fortemente com CTAB e 'caem' da solução: você mantém seu DNA na fase líquida e purifica, com o excesso de sal lavado no final usando lavagens repetidas de EtOH a 70%.

O excesso de Na + / Cl- nivelaria efetivamente as propriedades 'seletivas' do CTAB? 'Salting-Out' o DNA da solução (rompendo a camada de solvatação) é usado na etapa 4, mais frequentemente com acetato de sódio e 2-propanol: quanto sal pode ser usado nas etapas 1 2 antes que o DNA seja precipitado com outro materiais orgânicos? Existem outras considerações (por exemplo, sais e solventes orgânicos na Etapa 3)?

A primeira descrição que encontrei para isso é Zhou (1996), mas um protocolo realmente bom sobre isso é Wilson (2001).

*: presumivelmente?


Muito sal pode danificar os vasos sanguíneos e levar à hipertensão

Comer uma dieta rica em sal por vários anos pode danificar os vasos sanguíneos - aumentando o risco de desenvolver pressão alta, de acordo com uma pesquisa relatada no jornal American Heart Association Circulação.

Pessoas com esse tipo de lesão nos vasos sanguíneos que comem uma dieta rica em sal têm maior probabilidade de desenvolver hipertensão ou pressão alta. Esta pesquisa sugere a presença de um "ciclo de amplificação de sódio" no qual comer muito sal por um longo tempo danifica os vasos sanguíneos, levando a uma maior chance de desenvolver hipertensão se a dieta rica em sal for continuada.

Os pesquisadores não avaliaram a relação de causa e efeito entre a ingestão de sal e pressão alta. Mas os resultados do estudo "acrescentam evidências consideráveis ​​de que uma dieta rica em sal está intimamente ligada à hipertensão", disse John Forman, MD, principal autor do estudo e nefrologista do Brigham and Women's Hospital e da Harvard Medical School em Boston , Mass.

"Além disso, este estudo reforça as diretrizes apoiadas pela American Heart Association e outras organizações profissionais que recomendam a redução do consumo de sal para minimizar o risco de desenvolver hipertensão", disse Forman.

Um grama de sódio é igual a 2,5 gramas de sal de cozinha (cloreto de sódio).

Os pesquisadores conduziram um estudo observacional (PREVEND) no qual rastrearam a ingestão de sódio de 5.556 homens e mulheres da população geral de Groningen, Holanda. A ingestão de sódio foi avaliada por meio da coleta de múltiplas amostras de urina de 24 horas, que é considerado o método ideal para medir a ingestão de sódio.

Os pesquisadores analisaram a associação entre o consumo de sódio e os níveis sanguíneos de ácido úrico e albumina na urina - ambos marcadores de danos nos vasos sanguíneos - em participantes que não tomavam remédios para hipertensão.

Durante um acompanhamento médio de 6,4 anos, foram feitos 878 novos diagnósticos de hipertensão.

A maior ingestão de sódio foi associada a níveis crescentes de ácido úrico e albumina ao longo do tempo. Quanto mais altos os níveis desses marcadores, maior o risco de desenvolver hipertensão se a ingestão de sal na dieta for alta, descobriram os pesquisadores. Em comparação com os participantes que ingeriram a menor quantidade de sódio (cerca de 2.200 miligramas por dia), aqueles que comeram mais (cerca de 6.200 mg / d) tiveram 21 por cento mais probabilidade de desenvolver pressão alta. No entanto, aqueles que tinham níveis elevados de ácido úrico e comiam mais sal tinham 32 por cento mais probabilidade de desenvolver pressão alta, enquanto aqueles com altos níveis de albumina na urina e maior ingestão de sal tinham 86 por cento mais chances de desenvolver pressão alta.

Acredita-se que uma dieta rica em sal seja responsável por 20 a 40% de todos os casos de pressão alta nos Estados Unidos.

Como o estudo envolveu apenas caucasianos europeus, os resultados devem ser replicados em hispânicos, afro-americanos e outros nos Estados Unidos. No entanto, outros pesquisadores encontraram uma ligação entre uma dieta rica em sal e pressão alta nessas outras populações, disse Forman. .

Os co-autores são Lieneke Scheven, M.D. Paul de Jong, M.D. Stephan Bakker, Ph.D. Gary Curhan, M.D. e Ron Gansevoort, M.D.

A American Heart Association, o Instituto Nacional de Diabetes, Doenças Digestivas e Renais e a Fundação Holandesa do Rim financiaram o estudo.


O sal é uma droga, as células incham

A água nas células se move em direção à maior concentração de sal. Se houver mais sal em uma célula do que fora dela, a água se moverá através da membrana para dentro da célula, fazendo com que ela aumente de tamanho, inchando à medida que a água preenche a célula em seu imperativo de se combinar com o sal. Se uma concentração maior de sal for colocada fora da membrana celular, a água deixará a célula para se ligar a ela. A perda de água com esse movimento faz com que as células da planta encolham e murchem. É por isso que o sal pode matar as plantas, pois rouba a água das células. O movimento da água para deixar uma célula animal também fará com que essas células encolham e causem desidratação. É por isso que uma pessoa pode morrer de desidratação se beber bastante água do mar.

Bonnie Crowe é mãe de dois adolescentes, professora e autora de livros infantis, currículo e artigos sobre gramática inglesa, literatura, tecnologia, arte, criação de filhos e guias de carreira para alunos do ensino médio. Ela é ex-diretora da AOL Parenting, membro do SCBWI e graduada pela University of California, Berkeley.


Precipitação de DNA da extração de CTAB: Camada turva após a adição de etanol, mas sem pellet?

Normalmente extraio DNA de células animais, mas agora preciso extrair DNA de plantas. Realizei uma extração CTAB, conforme sugerido pelo Google. Eu cheguei na parte da precipitação do DNA. Eu adicionei acetato de sódio e etanol frio, e uma camada turva apareceu exatamente como o que eu experimentei antes em extratos de DNA de animais. No entanto, nenhum pellet de DNA se formou após a centrifugação. No entanto, ainda havia uma camada turva no tubo. Acho que o DNA ainda está naquela camada nebulosa. Vocês têm alguma ideia de por que o DNA não se precipita?

Você fez uma extração de clorofórmio: IAA antes da precipitação? Sempre que eu coloco qualquer parte da interface no sobrenadante, um pellet não se forma.

I & # x27ll inclui o protocolo CTAB I & # x27m usando para Ficus folhas abaixo. Um estudante de graduação com quem eu estava trabalhando usou esse protocolo para extrair 10x mais volume por vez do que eu, e ele obteve um resultado semelhante ao seu (uma camada turva em vez de um pellet, não importa quanto tempo ele centrifugou). Nós apenas dissemos a ele para retirar o máximo de isopropanol possível e, em seguida, prosseguir com a lavagem com etanol normalmente.

☐ Defina a incubadora para 65 ° C. Coloque 100% de isopropanol no congelador.

☐ Coloque o pedaço de folha no tubo junto com 2 contas de metal. Quebre a folha com uma pinça ou tesoura.

☐ Moa a 30 RPM por 1 min.

☐ Adicione 600 uL de tampão CTAB à temperatura ambiente. Vórtice.

☐ Repita a moagem mais duas vezes, batendo e agitando o tubo no meio para desalojar todo o material da folha.

☐ Incubar a 65 ° C por 45 min. Agite no vórtice a cada 15 min.

☐ Centrifugue na velocidade máxima por 2 min.

☐ Transfira o sobrenadante para o novo tubo (cerca de 450 uL).

☐ Adicione 100 µL de clorofórmio: álcool isoamílico 24: 1.

☐ Vortex completamente. Incubar em temperatura ambiente por 2 min.

☐ Agite novamente no vórtex e centrifugue na velocidade máxima por 2 min.

☐ Transfira o sobrenadante (apenas fase superior) para um novo tubo (aprox. 400 uL).

☐ Repita clorofórmio: extração de isoamila (as quatro etapas acima - volume do sobrenadante aprox. 300 uL).

☐ Adicione 1,5 volumes de isopropanol a -20 ° C (aprox. 450 uL).

☐ Incube as amostras à temperatura ambiente por 10 min.

☐ Centrifugue na velocidade máxima por 5 min. Pellet vai se formar. Se uma camada de líquido pesado se formar, algum C: IAA foi transportado.

☐ Remova o sobrenadante, retendo a fase inferior.

☐ Adicione 600 uL de etanol a 70% à temperatura ambiente.

☐ Inverta para desalojar o pellet do fundo do tubo. Incubar a 4 ° C durante a noite (ou por pelo menos 2 horas).


Precipitação de PEG de bibliotecas de DNA - Como funciona o Ampure ou o SPRIselect

Uma pergunta que nos foi feita, e uma que nossos fornecedores de NGS são frequentemente feitas, é como, em princípio, o PEG precipita o DNA na limpeza da preparação da biblioteca de sequenciamento da próxima geração? Normalmente ouvimos a pergunta apresentada como: como as esferas Ampure XP ou SPRIselect da Agencourt precipitam o DNA? A resposta tem a ver com as propriedades químicas do DNA, polietilenoglicol (PEG), as contas sendo usadas e água. Grânulos de poliestireno - magnetita (Ampure) são revestidos com uma camada de grupos carboxila carregados negativamente. A estrutura de fosfato altamente carregada do DNA o torna polar, permitindo que se dissolva prontamente em água (também polar). Quando PEG [H- (O-CH2-CH2)n-OH] é adicionado a uma solução de DNA em condição de saturação, o DNA forma grandes bobinas aleatórias. Adicionar esta molécula hidrofílica com a concentração correta de sal (Na +) faz com que o DNA se agregue e precipite para fora da solução por falta de solvatação (1, 2). Muito sal e você terá muito DNA salgado, muito pouco resultará em uma recuperação deficiente. Os íons Na + protegem os esqueletos de fosfato negativos, fazendo com que o DNA se cole e em qualquer outra coisa que esteja nas proximidades (incluindo grânulos carboxilados). Quando estiver pronto para eluir seu DNA e colocá-lo de volta na solução (depois de fazer a seleção do tamanho ou a remoção de enzimas, nucleotídeos, etc.), uma solução aquosa é adicionada de volta (TE ou água) hidratando totalmente o DNA e movendo-o de um estado agregado de volta para a solução. A carga negativa dos grânulos de carboxila agora repele o DNA, permitindo ao usuário extraí-lo do sobrenadante. Mudar a quantidade de PEG e a concentração de sal pode ajudar na seleção do tamanho do DNA (2). Este é um método comum na preparação da biblioteca NGS, onde o usuário está interessado na seleção do tamanho de um fragmento de tamanho específico. É frequentemente usado para substituir as etapas de gel na preparação da biblioteca NGS. Já existe uma vasta literatura sobre as condições de selecionar o tamanho do DNA, basta fazer uma simples pesquisa no Google. O primeiro artigo que descobrimos que descreve essa seleção é mencionado abaixo (3).

Desde esta publicação em 7 de maio de 2014, existem vários grânulos de seleção de tamanho do tipo Ampure mais comerciais no mercado:


Guia de solução de problemas para extração e purificação de DNA genômico (NEB # T3010)

Precisa de ajuda para purificar o DNA genômico com o Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB # T3010)? Estamos aqui para ajudar. Nosso guia de solução de problemas abaixo descreve alguns dos pontos mais comuns que os cientistas encontram durante a purificação do gDNA. Você também pode encontrar orientação sobre como escolher as quantidades de entrada adequadas em nosso recurso online, Escolhendo as quantidades de entrada para o Monarch Genomic DNA Purification Kit. Ainda está tendo problemas? Contate nosso suporte técnico a qualquer momento.

  • Descongele os pellets de células lentamente no gelo e agite o tubo várias vezes para liberar o pellet do fundo do tubo. Certifique-se de usar PBS frio para ressuspensão e ressuspender suavemente pipetando para cima e para baixo 5 & ndash10 vezes até que uma suspensão de células uniformemente turva seja obtida e o pellet esteja completamente dissolvido.
  • Adicione Proteinase K e RNase A à amostra e misture bem antes de adicionar o Tampão de Lise Celular, caso contrário, a alta viscosidade do lisado impedirá a mistura adequada das enzimas.
  • Mantenha as amostras de sangue congeladas e adicione Proteinase K, RNase A e Tampão de Lise de Sangue diretamente nas amostras congeladas. Comece a lise imediatamente e deixe as amostras descongelarem após a incubação da lise.
  • O sangue total fresco (descongelado) não deve ter mais de uma semana. Amostras mais antigas mostrarão uma quantidade progressiva de degradação do DNA e perda de rendimento.
  • A digestão de amostras de sangue total de algumas espécies animais com alto teor de hemoglobina (por exemplo, cobaia) pode levar ao acúmulo de complexos de hemoglobina insolúveis que mancham e obstruem a membrana, levando a um rendimento e pureza reduzidos. Reduza o tempo de lise da Proteinase K de 5 para 3 minutos para evitar a formação desses precipitados.
  • Corte o material inicial nos menores pedaços possíveis ou triture com nitrogênio líquido. Em grandes pedaços de tecido, as nucleases destroem o DNA antes que a Proteinase K possa lisar o tecido e liberar o DNA.
  • A digestão da proteína K de tecidos fibrosos (por exemplo, músculo, coração, pele, clipes de orelha), tecido cerebral e todos os tecidos estabilizados com RNA mais tarde leva à liberação de pequenas fibras de proteína indigestíveis que muitas vezes dão ao lisado uma aparência turva. Essas fibras irão bloquear os locais de ligação da membrana de sílica, reduzindo o rendimento e causando a contaminação das proteínas. Para remover as fibras, centrifugar o lisado em velocidade máxima por 3 minutos, conforme indicado no protocolo. Para clipes de orelha e tecido cerebral, não use mais do que 12 & ndash15 mg de material de entrada, caso contrário, a remoção da fibra não será completa.
  • As amostras que são armazenadas por longos períodos de tempo em temperatura ambiente, 4 & degC ou -20 & degC mostrarão degradação e perda do conteúdo de gDNA ao longo do tempo. Congele rapidamente as amostras de tecido com nitrogênio líquido ou gelo seco e armazene-as a -80 e degC. Alternativamente, use reagentes de estabilização para proteger o gDNA e permitir o armazenamento por longos períodos de tempo a 4 ° C ou -20 ° C.
  • Tecidos de órgãos como pâncreas, intestino, rim e fígado contêm quantidades significativas de nucleases. Eles devem ser tratados com extremo cuidado e armazenados de forma adequada para evitar a degradação do DNA. Mantenha congelado e em gelo durante a preparação da amostra. Consulte o protocolo para obter a quantidade recomendada de material de partida e Proteinase K a ser usada.
  • Alguns tecidos de órgãos (por exemplo, baço, rim, fígado) são extremamente ricos em DNA genômico. A tentativa de processar quantidades maiores do que as quantidades de entrada recomendadas resultará na formação de nuvens de gDNA de fragmentos longos emaranhados que não podem ser eluídos da membrana de sílica. Reduza a quantidade de material de entrada para obter um rendimento maior.
  • A maioria das amostras são digeridas com 10 µol de Proteinase K, mas para clipes de cérebro, rim e orelha, o uso de 3 µol fornecerá melhores rendimentos.
  • As amostras que são armazenadas por longos períodos de tempo em temperatura ambiente, 4 & degC ou -20 & degC mostrarão degradação e perda do conteúdo de gDNA ao longo do tempo. Congele amostras de tecido com choque com nitrogênio líquido ou gelo seco e armazene-as a -80 ° C. Alternativamente, use reagentes de estabilização, como RNAlater para proteger o gDNA e permitir o armazenamento por longos períodos de tempo a 4 ° C ou -20 ° C.
  • Corte o material inicial nos menores pedaços possíveis ou triture com nitrogênio líquido. Em pedaços grandes de tecido, as nucleases degradarão o DNA antes que a Proteinase K possa lisar o tecido e liberar o DNA.
  • Os tecidos de órgãos como o pâncreas, intestino, rim e fígado têm um conteúdo de nuclease muito alto. Eles devem ser tratados com extremo cuidado (consulte a seção & lsquoA amostra não armazenada corretamente & rsquo acima) para evitar a degradação do DNA. Mantenha congelado e em gelo durante a preparação da amostra.
  • O sangue total fresco (descongelado) não deve ter mais de uma semana. Amostras mais antigas mostrarão uma quantidade progressiva de degradação do DNA e perda de rendimento.
  • O descongelamento de amostras de sangue congeladas libera DNase, causando degradação. Mantenha as amostras de sangue congeladas e adicione enzimas e tampão de lise diretamente às amostras congeladas. Comece a lise imediatamente e deixe as amostras descongelarem após a incubação da lise.

O sal de guanidina foi transportado para o eluato:

O tampão de ligação contém tiocianato de guanidina (GTC), que mostra uma absorvância muito forte a 220 & ndash230 nm.

A forma mais comum de introdução do sal no eluato é permitindo que a mistura tampão / lisado entre em contato com a área superior da coluna.

    Ao transferir a mistura de lisado / tampão de ligação, evite tocar na área superior da coluna com a ponta da pipeta, pipete sempre cuidadosamente na membrana de sílica.


Adaptação de Escherichia coli ATCC 8739 a 11% NaCl

Escherichia coli (E. coli) é um micróbio não halofílico e usado para indicar contaminação fecal. O sal (cloreto de sódio, NaCl) é um aditivo alimentar comum e é usado em conservantes para detectar o crescimento microbiano. O efeito de como E. coli interage com o sal presente na dieta humana não é claro. Portanto, é importante investigar essa relação. A fim de se adaptar e sobreviver às mudanças no ambiente, E. coli pode sofrer halofilização. Neste estudo, observamos as mudanças genéticas e a cinética de crescimento de E. coli ATCC 8739 com NaCl 3% –11% em 80 passagens. Nossos resultados sugerem que E. coli adaptado a 1% de aumento no NaCl a cada mês com uma adaptação bem-sucedida ao 11% NaCl. A coloração de Gram e PCR / RFLP mostraram que as culturas são Gram negativas e os perfis de DNA de todas as 4 réplicas são semelhantes, sugerindo que as culturas não foram contaminadas.

1. Introdução

Escherichia coli é um exemplo de livro didático de bactérias não-halofílicas e é um organismo indicador de contaminação fecal da água como E. coli é um preditor mais consistente de doença gastrointestinal do que outros indicadores bacterianos na água [1]. Isso corrobora Burton et al. [2] quem sugeriu que E. coli foi um preditor adequado de Salmonella enterica serovar Newport em vários sedimentos de água doce e foi observado que sobrevive por tanto tempo quanto ou mais do que Salmonella spp., cumprindo assim seu requisito como indicador para bactérias patogênicas. Além disso, a sobrevivência de E. coli é independente da quantidade de matéria orgânica [2]. Isso sugeriu que E. coli é um indicador adequado, pois pode sobreviver em meios de diferentes riquezas nutricionais.

Estudos anteriores [3-6] sobre a adaptação e evolução de E. coli foram realizados com antibióticos e medicamentos. No entanto, o aditivo alimentar comum, como o sal, que é usado para preservar alimentos e inibir microorganismos, é menos compreendido em termos de E. coliMecanismo adaptativo, embora estudos recentes [7, 8] tenham sugerido que E. coli é capaz de se adaptar a aditivos alimentares em uma cultura estendida. Isso sugere que E. coli pode ser capaz de se adaptar a concentrações mais altas de aditivos alimentares, mas isso ainda não foi estudado. Doudoroff [9] demonstrou que a contagem viável de E. coli previamente cultivadas em meio comum de água doce e então transferidas para soluções salinas de nutrientes permaneceram em uma concentração constante de NaCl de até 7%. A contagem viável caiu progressivamente com novo aumento na concentração, sugerindo que E. coli é não-halofílico e o NaCl a 7% é bacteriostático. Hrenovic e Ivankovic [10] relataram que o crescimento de E. coli é ideal abaixo de 5% NaCl. A adaptação de E. coli ao sal pode sugerir resistência semelhante a outros conservantes e sua capacidade de crescer em ambiente salino pode estar subestimada.

Este estudo visa observar a adaptação gradual de E. coli ATCC 8739, uma cepa totalmente sequenciada, cultivada em meio suplementado com NaCl até 8% de NaCl em 80 passagens. Nossos resultados sugerem que E. coli adaptado a 1% de aumento no NaCl a cada mês com uma adaptação bem-sucedida ao 11% NaCl. A coloração de Gram e a impressão digital de DNA por PCR / polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição na passagem 72 mostraram que as culturas são Gram negativas e os perfis de PCR-RFLP de todas as 4 réplicas são semelhantes. Isso sugere que as culturas não foram contaminadas com Staphylococcus aureus, que é Gram positivo e o contaminante mais provável como S. aureus é um comensal tolerante ao sal encontrado na pele humana.

2. Metodologia

O experimento de cultura principal foi realizado com um inóculo inicial de

E. coli As células ATCC 8739 da passagem 70 de Lee et al. [8] como a primeira passagem em cada uma das 4 réplicas de 10 mL de caldo nutriente 1X com uma concentração fixa de NaCl (nos referimos a isso como meio de adaptação) e cultivadas em tubos cônicos de 15 mL firmemente tampados. A subcultura foi realizada usando 1% da cultura anterior em todos os dias ímpares, exceto aos domingos (3 subculturas por semana). A concentração de NaCl para as passagens foi a seguinte: passagens 1 a 15 com NaCl 3%, passagens 16 a 31 com NaCl 4%, passagens 32 a 39 com NaCl 4,5%, passagens 40 a 50 com NaCl 5%, passagens 51 a 62 em NaCl 6%, passagens 63 a 74 com NaCl 7% e passagens 75 a 80 com NaCl 8%.

O monitoramento da contaminação foi o seguinte. As culturas foram monitoradas rotineiramente para contaminação usando coloração de Gram e impressão digital de DNA. A impressão digital de DNA por PCR / polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição foi realizada usando o procedimento em um estudo de adaptação semelhante anterior [8], onde cada um dos 3 primers (Primer 5, CgCgCTggC Primer 6, gCTggCggC e Primer 7, CAggCggCg) foi usado como ambos. e primers reversos. A reação de PCR foi realizada (Hybaid Limited, PCR expressa) sob a condição de ciclagem de desnaturação inicial a 95 ° C por 10 minutos 35 ciclos de amplificação a 95 ° C por 1 minuto, 27 ° C por 1 minuto e 72 ° C por 3 minutos seguido por uma extensão final a 72 ° C por 10 minutos antes da digestão com 1 unidade de endonuclease de restrição TaqI por 16 horas a 65 ° C antes da análise em gel de agarose 2% (p / v) com GelRed 1X.

O monitoramento da passagem foi o seguinte. As condições de crescimento de cada passagem foram monitoradas por densidade óptica em comprimento de onda de 600 nm (leituras de OD600) usando espectrofotômetro de luz / UV Shimadzu UV-1601. A leitura de OD600 de cada réplica foi feita antes de cada subcultura para estimar a densidade do inóculo. As leituras de OD600 foram feitas no quinto e sétimo dias após a inoculação para estimar a densidade celular na fase estacionária. A cada terceira passagem, 10

L de E. coli a cultura de cada repetição (A, B, C e D) foi inoculada em 1 mL de caldo nutriente 1X e leituras de OD600 feitas em intervalos de até 360 minutos e podem ser usadas para estimar o tempo de geração.

Para cultura MIC, 1% de E. coli cultura de cada repetição (A, B, C e D) foi inoculada em 1 mL de caldo nutriente 1X suplementado com 0% (p / v) NaCl, 1% (p / v) NaCl, 3% (p / v) NaCl, 5% (w / v) NaCl, 7% (w / v) NaCl, 9% (w / v) NaCl e 11% (w / v) NaCl de diferentes concentrações de sal. Para a colônia MIC, cada amostra de E. coli foi semeado em ágar nutriente e incubado durante a noite a 37 ° C. Dez colônias foram retiradas aleatoriamente de cada placa e inoculadas em 1 mL de caldo nutriente 1X e incubadas durante a noite a 37 ° C antes da inoculação em 1 mL de caldo nutriente 1X suplementado com diferentes concentrações de sal. O meio inoculado foi incubado por 21–23 horas a 37 ° C antes de fazer leituras de OD600.

3. Descrição do conjunto de dados

O conjunto de dados associado a este documento de conjunto de dados consiste em 5 itens que são descritos a seguir.

Conjunto de dados, item 1 (tabela). Leituras de OD600 para cada réplica tomadas no dia da próxima subcultura que podem ser usadas para estimar a densidade do inóculo de cada passagem e o número de gerações entre cada cultura. A tabela está em formato longo, onde cada linha possui apenas um atributo de dados medidos. Neste caso, os dados medidos serão as leituras OD600. Os outros atributos são descritores do atributo de dados medidos. Isso se opõe ao formato amplo em que os descritores para uma leitura OD600 particular são fornecidos como rótulos de linha e coluna. A tabela contém apenas 3 atributos: Passagem, Replicação e Leitura OD600 denotando o número da passagem, as réplicas marcadas de “A” a “D” e a medição OD600, respectivamente.

  • Coluna 1: Passagem
  • Coluna 2: Replicar
  • Coluna 3: Leitura OD600

Conjunto de dados, item 2 (tabela). Leituras de OD600 para cada réplica tomadas no quinto e sétimo dias após a inoculação para estimativa da densidade celular em fase estacionária. A tabela está em formato longo, onde cada linha possui apenas um atributo de dados medidos. Neste caso, os dados medidos serão as leituras OD600. Os outros atributos são descritores do atributo de dados medidos. Isso se opõe ao formato amplo em que os descritores para uma leitura OD600 particular são fornecidos como rótulos de linha e coluna. A tabela contém 4 atributos: Passagem, Replicação, Dia e Leitura OD600 denotando o número da passagem, as réplicas marcadas de “A” a “D”, se a leitura OD600 foi realizada no quinto ou sétimo dia após a inoculação, e o OD600 medição, respectivamente.

  • Coluna 1: Passagem
  • Coluna 2: Replicar
  • Coluna 3: Dia
  • Coluna 4: Leitura OD600

Item 3 do conjunto de dados (tabela). Leituras de OD600 feitas na inoculação (tempo zero ou zero minutos), 2 horas após a inoculação e em intervalos regulares após a segunda hora. Esses dados podem ser usados ​​para estimativa de tempo de geração. A tabela está em formato longo, onde cada linha possui apenas um atributo de dados medidos. Neste caso, os dados medidos serão as leituras OD600. Os outros atributos são descritores do atributo de dados medidos. Isso se opõe ao formato amplo em que os descritores para uma leitura OD600 particular são fornecidos como rótulos de linha e coluna. A tabela contém 4 atributos: Passagem, Replicação, Minutos e Leitura OD600 denotando o número da passagem, as réplicas rotuladas de “A” a “D”, a quantidade de tempo em minutos após a inoculação quando as leituras OD600 foram feitas e o OD600 medição, respectivamente.

  • Coluna 1: Passagem
  • Coluna 2: Replicar
  • Coluna 3: Minutos
  • Coluna 4: Leitura OD600

Item 4 do conjunto de dados (tabela). Leituras OD600 do experimento MIC de cada réplica. A tabela está em formato longo, onde cada linha possui apenas um atributo de dados medidos. Neste caso, os dados medidos serão as leituras OD600. Os outros atributos são descritores do atributo de dados medidos. Isso se opõe ao formato amplo em que os descritores para uma leitura OD600 particular são fornecidos como rótulos de linha e coluna. A tabela contém 4 atributos: passagem, réplica, [NaCl] e leitura OD600 denotando o número da passagem, as réplicas marcadas de "A" a "D", a concentração de NaCl para estimativa de MIC e a medição de OD600, respectivamente (ver A Tabela 1 contém dados replicados fornecidos em formato amplo para fácil referência).

  • Coluna 1: Passagem
  • Coluna 2: Replicar
  • Coluna 3: [NaCl]
  • Coluna 4: Leitura OD600

Item 5 do conjunto de dados (tabela). Leituras de OD600 do experimento MIC de cada colônia em que 10 colônias aleatórias foram selecionadas para cada repetição (total de 40 colônias foram escolhidas) após o isolamento de uma única colônia de cada uma das 4 repetições. Neste caso, os dados medidos serão as leituras OD600. Os outros atributos são descritores do atributo de dados medidos. Isso se opõe ao formato amplo em que os descritores para uma leitura OD600 particular são fornecidos como rótulos de linha e coluna. A tabela contém 5 atributos: Passagem, Replicar, Colônia, [NaCl] e Leitura OD600 denotando o número da passagem, as réplicas rotuladas de “A” a “D”, a colônia em 2 alfabetos onde o primeiro alfabeto denota a replicação e o o segundo alfabeto denota a colônia, a concentração de NaCl para estimativa de MIC e a medição de OD600, respectivamente. Por exemplo, a colônia rotulada como “DA” representa a colônia “A” da réplica “D” (consulte as Tabelas 2, 3 e 4 contendo dados MIC da colônia fornecidos em formato amplo para fácil referência).

  • Coluna 1: Passagem
  • Coluna 2: Replicar
  • Coluna 3: Colônia
  • Coluna 4: [NaCl]
  • Coluna 5: Leitura OD600

4. Observações finais

Nossos resultados de MIC mostraram um aumento nas leituras de OD600 de meio nutriente suplementado com NaCl de 11% (p / v) após a passagem 60 (Figura 1), sugerindo que E. coli adaptou-se a 11% (p / v) de NaCl. Isso é verificado posteriormente por MIC em colônias selecionadas aleatoriamente na passagem 72 (Tabela 4). Assim, este estudo fornece um conjunto de dados que podem ser usados ​​como referência para outros estudos de adaptação. A coloração de Gram e PCR-RFLP com base em estudos anteriores [7, 8] na passagem 72 (Figura 2) mostraram que as culturas são Gram negativas e os perfis de PCR-RFLP de todas as 4 réplicas são semelhantes. Isso sugere que as culturas não foram contaminadas.


Solos salino-sódicos

Solos salino-sódicos são como solos salinos, exceto que eles têm concentrações significativamente mais altas de sais de sódio em relação aos sais de cálcio e magnésio.

Solos salino-sódicos normalmente têm uma CE de menos de 4 mmho cm-1, e o pH é geralmente abaixo de 8,5. A porcentagem de sódio trocável é mais do que 15 por cento da capacidade de troca catiônica (CEC). CEC é uma medida da capacidade do solo de reter cátions, ou seja, cálcio, magnésio, potássio, sódio, hidrogênio e alumínio. Quanto maior o CEC, mais problemática será a remoção e remediação do problema do sal.

A água se move por esses solos da mesma forma que nos solos salinos, embora as etapas para corrigir o solo sódico salino sejam diferentes. Simplesmente lixiviar os sais deste solo irá convertê-lo de solos salinos-sódicos em solos sódicos.


Calicreína 10 de rato, Proteinase K da glândula salivar

Atividade e especificidade

Proteinase K mostra uma preferência por clivagem de ligações Arg-X em substratos de moléculas pequenas e libera T-quininina a partir de T-quininogênio. Ele também forma complexos SDS e estáveis ​​ao calor com a proteína de ligação à calicreína de rato recombinante purificada em vitro [6]. A enzima (como antígeno γ) agiu sobre o T-cininogênio com um Km de 29 ± 4 μM e um kgato/Km de 140 M –1 s –1. Com H- e L-cininogênios, 7,4 e 10 μg de kinin h −1 mg −1, respectivamente, foram liberados [4].

Proteinase K (como T-quininogenase) mostrou ser diferente da calicreína tecidual em suas interações nos subsites S2, S1 ′ e S2 ′. Aproveitando essas diferenças, substratos de fluorescência extinta seletiva foram projetados, contendo o Abz (o-aminobenzoil) como fluoróforo e EDDnp (2,4-dinitrofenil-etilenendiamina) como inibidor. Abz-Phe-Arg ↓ Ser-Arg-EDDnp, com Arg em P2 ′, é um bom substrato para calicreínas teciduais de cavalo, porco e rato, mas não para proteinase K. Em contraste, Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val -EDDnp e Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val-Arg-EDDnp (a sequência do T-cininogênio) são bons substratos para a proteinase K, mas não para a calicreína tecidual. Arg em P1 ′, P2 ′ ou P3 ′ diminui o Km valores de proteinase K, enquanto Val em P2 ′ aumenta kgato [7]. A proteinase K cliva especificamente após resíduos Arg, como a verdadeira calicreína de tecido, mas difere da calicreína de tecido por ser capaz de acomodar resíduos polares ou não polares em P2.

Excepcionalmente para uma serina proteinase, a atividade da proteinase K é aumentada 10 vezes pela presença de um composto de tiol como o DTT. Os inibidores incluíram leupeptina, aprotinina, Tos-Lys-CH2Cl e inibidor de tripsina de soja. Pepstatina e PMSF não inibiram a enzima [3,8].

O pH ótimo é cerca de 8,0 [3]. Os ensaios são mais convenientemente feitos com os substratos peptídicos fluorogênicos extintos intramolecularmente Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val-EDDnp e Abz-Phe-Arg ↓ Leu-Val-Arg-EDDnp [7].


DISCUSSÃO

NaCl inibe o reparo de PSII

Estudos anteriores da maquinaria fotossintética in vivo demonstraram que o estresse salino aumenta a inativação induzida pela luz de PSII (Neale e Melis, 1989 Lu e Zhang, 1999). No presente estudo, confirmamos os efeitos sinérgicos negativos do estresse luminoso e do estresse salino no complexo PSII em Synechocystis. The extent of the light-induced inactivation of PSII reflects a balance between the rate at which damage is induced and the rate of repair of PSII ( Greer et al., 1986). In our experimental system, the light-induced damage to PSII and the repair of PSII were clearly separate phenomena. Damage was inflicted by strong light (500 μE m −2 s −1 ) in the presence of lincomycin (Fig. 1), whereas repair was achieved in weak light (70 μE m −2 s −1 ) after PSII had been damaged by exposure of cells to very strong light (2,000 μE m −2 s −1 Figs. 2 and 3). Salt stress (1.0 m NaCl) strongly inhibited repair, but had no effect on the light-induced damage to PSII.

In natural habitats, photosynthetic organisms are often exposed to light stress and, in many instances, salt stress is combined with light stress. Thus, the combined effects of salt and light stress are of considerable importance in nature and agriculture.

NaCl Inhibits the Synthesis of Proteins de Novo

A schematic representation of the proposed steps required for expression of psbA genes and the synthesis of D1, with sites of apparent inhibition by high levels of NaCl (T bars weaker inhibition is indicated by broken T bars). A, 1.0 m NaCl. B, 0.5 m NaCl.

A schematic representation of the proposed steps required for expression of psbA genes and the synthesis of D1, with sites of apparent inhibition by high levels of NaCl (T bars weaker inhibition is indicated by broken T bars). A, 1.0 m NaCl. B, 0.5 m NaCl.

We observed two bands after western blotting with antibodies against the carboxy-terminal extension of pre-D1, namely, the amino acid sequence SGEGAPVALTAPAVNG. Shestakov et al. (1994) demonstrated that pre-D1 is converted to D1 by CtpA, a specific carboxy-terminal-processing protease. Inagaki et al. (2001)demonstrated that this processing involves two separate steps and, moreover, that the top and bottom bands observed after gel electrophoresis correspond to pre-D1 (pre-D1-1) and an intermediate in the processing of pre- D 1-1, namely, pre-D1-2.

Western-blotting analysis of pre-D1 (Fig. 6) indicated that levels of pre-D1-1 and pre- D 1-2 in cells that had been incubated in the presence of 0.5 m NaCl were about 50% of those in low-salt medium (20 m m NaCl), which might correspond to the 50% level of recovery of PSII activity shown in Figure 2. The level of pre-D1 is the result of a balance between the synthesis, processing, and degradation of the protein, and the results in Figure 7 indicate that NaCl had no effect on the processing and degradation of either form of pre- D 1. Northern-blotting analysis, for which results are shown in Figures 8 and 9, demonstrated that in the presence of 0.5 m NaCl, the accumulation of psbAtranscripts was delayed, but the maximum level of psbAtranscripts was unaffected. These observations suggest that translation of psbA transcripts to yield pre-D1 was partially inhibited by 0.5 m NaCl.

Taken together, our results indicate that NaCl inhibited the transcription and translation of psbA genes (Fig. 10). However, inhibition of transcription was the salient factor that was primarily responsible for inhibition of the repair of the PSII complex at 1.0 m NaCl, whereas inhibition of translation was most responsible for the partial inhibition of repair at 0.5 m NaCl.

The Overall Transcription and Translation of Genes Is Affected by NaCl

The results of DNA microarray analysis (Table I) demonstrated that 1.0 m NaCl completely inhibited the light-induced accumulation of the transcripts of all the light-inducible genes, confirming the results of labeling with [ 35 S]Met. These observations suggest that inhibition of transcription by 1.0 m NaCl was the primary cause of inhibition of the light-induced synthesis of light-inducible proteins (Fig. 10). At 0.5 m NaCl, transcription of most of the light-inducible genes ceased to be inducible by light. However, the light inducibility of some light-inducible genes was enhanced to some extent. These results might correspond to the synthesis of a protein of 25 kD (Fig. 5), whose light inducibility was enhanced in 0.5 m NaCl. However, it is unclear which gene encoded the 25-kD protein.

The results of labeling with [ 35 S]Met (Fig. 5) demonstrated that 1.0 m NaCl inhibited the light-induced synthesis de novo not only of D1, but also of all other proteins. At 0.5 m , NaCl also inhibited the light-induced synthesis of all the light-inducible proteins, with a few exceptions, for example, the 25-kD protein. At 0.5 m NaCl, the light inducibility of the synthesis of D1 de novo was reduced and synthesis of the 25-kD protein appeared to be enhanced. Thus, the salt stress due to NaCl significantly depressed the light inducibility of the synthesis de novo of almost all of the light-inducible genes.


Drop Dialysis

1. Pour 30&ndash100 ml of dialysis buffer, usually double-distilled water or 1X TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), into a petri plate or beaker.

2. Float a 25 mm diameter, Type-VS Millipore membrane (MF type, VS filter, mean pore size = 0.025 &mum, Millipore, Inc. #VSWP 02500) shiny side up on the dialysis buffer. Allow the floating filter to wet completely (

5 minutes) before proceeding. Make sure there are no air bubbles trapped under the filter.

3. Pipette a few &mul of the DNA droplet carefully onto the center of the filter. If the sample has too much phenol or chloroform, the drop will not remain in the center of the membrane and the dialysis should be discontinued until the organics are further removed. In most cases, this is performed by alcohol precipitation of the sample. If the test sample remains in the center of the membrane, pipette the remainder on to the membrane.

4. Cover the petri plate or beaker and dialyze for 1 to 4 hours. Do not allow the sample to flip or become covered with dialysis buffer.

5. Carefully retrieve the DNA droplet with a micro-pipette and place in a microcentrifuge tube. Rinse the spot on the membrane with 50 &mul of 1X TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and add to the microcentrifuge tube.

6. Estimate the concentration of the DNA product using agarose gel electrophoresis or a spectrophotometer.

Notas
Step 4 may be tricky for those with shaky hands or poor handeye coordination. The filter has a tendency to move briskly around the surface as you touch it with the pipette tip. Practice with buffer droplets to master the technique before using a valuable sample.

Dialysis against double-distilled water is also recommended, especially if proceeding to another manipulation where EDTA might be a problem.

Steps 2 to 4 can be repeated with fresh buffer or for longer times if additional dialysis is required.